Quy trình nhuộm hóa học tế bào

I. NGUYÊN LÝ

Hóa học tế bào là phương pháp khảo sát một số thành phần có chứa trong bào tương của tế bào, dưới kính hiển vi quang học sau khi làm hiện màu bằng các thuốc nhuộm hoặc các cơ chất thích hợp.

1. Nguyên tắc chung

Tất cả các phương pháp nhuộm hóa học tế bào đều bao gồm ba giai đoạn:

– Cố định:Ngoài mục đích cố định tế bào trên tiêu bản, đối với mỗi phương pháp nhuộm phải lựa chọn hóa chất cố định hợp lý để bảo tồn tối đa thành phần cần khảo sát: ví dụ các không bào mỡ trong nhuộm Soudan Black, men peroxydase trong nhuộm Peroxydase,…

– Nhuộm: Dùng các thuốc nhuộm (Soudan Black) hay các cơ chất (benzidin, µnaphtol acetat,…) để trực tiếp hoặc gián tiếp làm hiện màu các thành phần cần khảo sát.

– Tạo nền:Dùng một thuốc nhuộm làm hiện màu hình thái tế bào (nhân và bào tương) trên tiêu bản. Màu nền phải có độ tương phản cần thiết để giúp quan sát thuận lợi các hạt dương tính trong mỗi phương pháp nhuộm.

2. Đảm bảo tiêu bản khô, sạch ở mỗi bước kỹ thuật

Phải loại bỏ hết chất cố định hay chất nhuộm và để khô tiêu bản trước khi chuyển sang bước tiếp theo.

II. CHỈ ĐỊNH

– Hỗ trợ phương pháp hình thái học để xác định dòng, mức độ biệt hóa tế bào trong phân loại lơ xê mi cấp, hội chứng rối loạn sinh tủy và các bất thường khác.

– Trong một số trường hợp đặc biệt, hóa học tế bào giúp xác định một quần thể tế bào có phải blast hay không: ví dụ các microblast dòng hạt trên tiêu bản Giemsa giống như lympho rối loạn hình thái.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

Cử nhân kỹ thuật, kỹ thuật viên Huyết học thuộc nhóm kỹ thuật chuyên sâu thực hiện quy trình này.

2. Phương tiện – Hóa chất

Hiện nay, hầu hết các Labo Huyết học – Tế bào đều sử dụng các phương pháp nhuộm hóa học tế bào bằng cách cố định tiêu bản bằng hơi formol 40% và dung dịch cồn formol 10%.

Mặc dù có thể sử dụng hóa chất của các hãng khác nhau, nhưng để đạt được hiệu quả tốt thì việc chuẩn bị các phương tiện để tiến hành kỹ thuật cũng có điểm chung như:

2.1. Dụng cụ

– Bể nhuộm thủy tinh dung tích 100ml: 2 chiếc;

– Bàn sấy, quạt sấy tiêu bản: 1 chiếc;

– Bain – marie (bình cách thủy) có điều chỉnh nhiệt độ;

– Pipette Pasteur: ³4 cái/1 tiêu bản;

– Pipette man loại 100 – 1000ml: 1- 2 cái, kèm đầu côn;

– Gạc thấm: 2 cái/1 tiêu bản;

– Lam kính làm tiêu bản theo nhu cầu;

– Giá cài tiêu bản: sử dụng theo số xét nghiệm;

– Kính hiển vi + dầu soi.

2.2. Hóa chất

– Cồn formol 10%: 100ml cho một đợt dùng;

– Cơ chất cho phản ứng: Soudan black, periodic acid shiff, benzidin, Napthol acetat…;

– Các hóa chất đệm phản ứng: Tris, TBS, PO4-3,…;

– Các hóa chất nhuộm nền như: Hematoxyllin, Giemsa, Nuclear Fasred…

3. Bệnh phẩm

– Sử dụng tiêu bản tủy xương hoặc tiêu bản máu ngoại vi (theo chỉ định);

– Tiêu bản được sấy khô và ghi các ký hiệu của kỹ thuật cần làm.

4. Phiếu xét nghiệm

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Kiểm tra: Trước khi tiến hành cần làm các thao tác sau:

– Kiểm tra thông tin tiêu bản (tên, tuổi người bệnh);

– Ghi ký hiệu trên tiêu bản (ví dụ: PAS, Peroxydase, Soudan Black …);

– Làm khô tiêu bản;

2. Quy trình kỹ thuật:

– Cố định tiêu bản (máu, tủy) trong cồn formol 10% hoặc hơi formol 40%: 10 phút.

– Rửa dưới dòng nước chảy mạnh (đối với cố định bằng cồn formol 10%), rửa nhẹ nhàng (đối với cố định bằng hơi formol 40%) rồi sấy khô tiêu bản: thường khoảng 5 – 10 phút.

– Nhuộm với cơ chất tùy từng loại xét nghiệm. Tùy theo mỗi loại xét nghiệm và cơ chất mà để thời gian phù hợp, tạo điều kiện cho phản ứng hiệu quả.

– Rửa dưới dòng nước chảy mạnh để loại bỏ hóa chất còn lại sau phản ứng và các tạp bẩn trên tiêu bản ®sấy khô tiêu bản.

– Nhuộm nền: Tùy theo mỗi loại xét nghiệm mà có hóa chất và thời gian nhuộm khác nhau để có chất lượng tốt.

– Rửa dưới dòng nước chảy mạnh ®sấy khô và làm đẹp, hoàn thiện tiêu bản.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Đánh giá mức độ dương tính

Độ 0: Không có hạt bắt màu hóa học tế bào là (-).

Độ 1: Các hạt bắt màu chiếm khoảng ≤ 1/3 bào tương tế bào là (+).

Độ 2: Các hạt bắt màu chiếm khoảng > 1/3 đến < 3/4 bào tương tế bào là (++).

Độ 3: Các hạt bắt màu chiếm hết bào tương tế bào là (+++).

Độ 4: Các hạt bắt màu chiếm hết bào tương và đè lên cả nhân tế bào là (++++).

2. Tính điểm (score)

Đánh giá mức độ dương tính hóa học tế bào của 100 tế bào cần nghiên cứu. Giả sử tỷ lệ phần trăm tế bào ở các độ 0, 1, 2, 3, 4 tương ứng với a, b, c, d, e thì công thức tính điểm như sau:

Score = (a x 0) + (b x 1) + (c x 2) + (d x 3) + (e x 4)

VII. THEO DÕI

Ở mỗi phương pháp nhuộm đều đòi hỏi nồng độ hóa chất và thời gian phản ứng khác nhau. Vì vậy, người tiến hành kỹ thuật phải theo dõi được thời gian phản ứng của mỗi xét nghiệm để chọn thời gian tối ưu cho phản ứng. Việc đó góp phần quan trọng đến việc có tạo ra sản phẩm chất lượng cao hay không.

VIII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Nhuộm hóa học tế bào đòi hỏi chặt chẽ về nồng độ hóa chất, thời gian phản ứng và điều kiện phản ứng. Nếu xảy ra sự cố thì xử trí bằng cách thực hiện quy chuẩn về các điều kiện cho mỗi loại xét nghiệm.